Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales  




Скачать 78.75 Kb.
PDF просмотр
НазваниеИсследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales  
Дата конвертации03.10.2012
Размер78.75 Kb.
ТипИсследование
Факультет Биоинженерии и Биоинформатики 
 
 
 
 
 
 
 
Исследование регуляции азотофиксации  
в бактериях порядка Rhizobiales  
методами сравнительной геномики 
 
 
 
 
 
 
 
 
Курсовая работа студентки 4-го курса 
К. В. Фоминых 
 
Научный руководитель: Д.  А. Равчеев. 
Старший научный руководитель: М. Г. Гельфанд  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Москва, 2005 
 
1

Введение 
Азотфиксация – важный биохимический процесс, представляющий собой восстановление 
молекулярного азота до аммония. К настоящему моменту установлено, что азотфиксация 
присуща  как  бактериям  разных  систематических  групп,  так  и  археям.  Таким  образом, 
распределение  азотфиксирующих  микроорганизмов  по  таксономическим  группам 
достаточно  мозаично.  Азотфиксирующие  микроорганизмы  могут  быть  как  свободно 
живущими, так и существовать в симбиозе с растениями (Мишустин и Емцев, 1987). 
Как было уже сказано выше, многие бактерии осуществляют фиксацию азота в симбиозе с 
высшими  растениями.  Наиболее  хорошо  изученные  симбиотические  азотфиксирующие 
бактерии являются представителями   группы Alphaproteobacteria.  Симбионтами в данном 
случае  являются  преимущественно  растения  из  порядка  бобовых (Fabales), причём 
клубеньки  образуются  лишь  у  представителей  семейства Fabaceae. Однако,  также 
известны  случаи  образования  корневых  клубеньков  и  у  небобовых  растений.  При 
свободном  существовании  азотфиксаторов  в  почве  данные  микроорганизмы  растут  как 
сапрофиты за счёт органических соединений. 
В  качестве  источника  азота  клубеньковые  растения  могут  использовать  различные 
соединения – соли  аммония  и  азотной  кислоты,  многие  аминокислоты,  пуриновые  и 
пиримидиновые  основания,  биурет  и  т.д.  На  обычных  средах  и  в  чистых  культурах 
клубеньковые  бактерии  не  усваивают  молекулярный  азот.  Также  было  установлено,  что 
всё-таки  на  специфических  питательных  средах  при  отсутствии  кислорода  чистые 
культуры  различных  бактерий  из  рода Rhizobium усваивают  некоторое  количество 
молекулярного азота (Мишустин и Емцев, 1987). 
Ткань,  заполненная  бактериями,  имеет  красноватую  окраску – она  содержит  пигмент 
леггемоглобин,  родственный  гемоглобину.  Молекулярный  азот  фиксируют  только  те 
клубеньки, в которых имеется леггемоглобин. Появление пигмента в ткани совпадает по 
времени  с  началом  фиксации  молекулярного  азота.  При  разрушении  леггемоглобина  с 
образованием  зелёных  желчных  пигментов  (биливердинов)  прекращается  и  связывание 
азота. Леггемоглобин, по всей вероятности, находится в цитоплазме растительной клетки, 
а не в пространствах между бактероидами и окружающими их мембранами. Образование 
пигмента представляет собой  специфический результат симбиоза: простетическая группа 
(протогем)  синтезируется  бактероидами,  а  белковый  компонент  при  участии  растения. 
Пигмент  обладает  очень  высоким  сродством    к  кислороду  и  можно  предполагать,  что 
леггемоглобин  облегчает  диффузию  кислорода  через  клетку  растения  к  бактероиду. 
Благодаря  особым  свойствам  леггемоглобина  в  бактероиде  возможно  создание 
микроаэробных условий (Шлегель, 1987). 
 
2

В настоящее время азотфиксация интенсивно изучается, однако подробные исследования 
проведены  лишь  для  некоторых  модельных  организмов.  К  настоящему  моменту 
азотфиксация    лучше  всего  изучена  в  организмах  из  порядка Rhizobiales, являющегося 
частью группы Alphaproteobacteria. 
 
Биохимия азотфиксации 
Нитрогеназа является центральным ферментом процесса азотфиксации. Данный фермент 
катализирует  биологическое  восстановление  молекулярного  азота  до  аммония  и 
представляет  собой  комплекс  структурно  и  функционально  консервативных 
металлоферментов.  Этот  комплекс  включает  в  себя 2 компонента:  железосодержащую 
АТФ-зависимую редуктазу нитрогеназы (Fe-белок) и динитрогеназу, содержащую железо 
и  молибден, (MoFe-белок).  Димерный Fe-белок  (γ2)  является  донором  электронов  для 
более  крупного  гетеротетрамерного MoFe-белка  (α2β2),  где  субъединицы  α,  β,  γ  
кодируются,  соответственно,  генами  nifD,  nifK,  и  nifH.  Субъединица  α  содержит 
каталитический сайт восстановления молекулярного азота, а также железомолибденовый 
кластер состава FeMo7S9.  
Все  азотфиксаторы  содержат MoFe-нитрогеназную  систему,  но  в  условиях  недостатка 
молибдена,  некоторые  организмы  индуцируют  синтез  альтернативных  нитрогеназ, 
содержащих кластеры, в которых молибден замещён на ванадий или железо.  
Полная стехиометрия восстановления азота под оптимальными условиями следующая: 
N2 + 8 e- + 8 H+ +16 ATP → 2NH3 + H2 +16 ADP + 16 Pi 
Как  видно  из  уравнения  реакции,  процесс  азотфиксации  является  энергозависимым  и 
требует присутствия АТФ. Кроме того, данная реакция требует присутствия ионов Mg2+. 
(Dixon and Kahn, 2004; Raymond, 2004). 
 
Генетика азотфиксации в бактериях порядка Rhizobiales 
Гены  азотфиксации  в  симбиотических  микроорганизмах  из  порядка Rhizobiales условно 
разделяют на 3 группы: 
-  nod-гены: продукты этих генов требуются для образования клубеньков.  
-  nif-гены:  гены,  структурно  гомологичные  nif-генам  гамма-протеобактерии 
Klebsiella    pneumoniae,  для  которой  генетика  азотфиксации  была  впервые 
исследована.  К  настоящему  моменту  идентифицировано 9 различных 
ризобиальных  nif  генов  в  организмах  Sinorhizobium meliloti,  Azorhizobium 
caulinodans  и Bradyrhizobium japonicum (Fischer, 1994). К  nif  генам  относятся 
 
3

структурные гены нитрогеназы; необходимые для биосинтеза нитрогеназы гены, а 
также гены регуляторных белков (Dixon and Kahn, 2004). 
-  fix-гены:  гены,  также  необходимые  для  азотфиксации,  но  не  гомологичные  nif-
генам  из  К. pneumoniae.  Данные  гены  представляют  собой  очень  разнородный 
класс  и,  кроме  того,  гены,  найденные  в  контексте  симбиотической  азотфиксации,  
могут  участвовать  в  процессах,  не  связанных  с  азотфиксацией  и  даже 
присутствовать в неазотфиксирующих организмах. (Fischer, 1994). 
Данная  классификация  является  исторически  сложившейся,  и  названия  генов  зачастую 
меняются после выяснения их точной функции. 
 
Регуляция азотфиксации в ризобиях 
В  микроорганизмах  может  осуществляться  как  физиологическая,  так  и  генетическая 
регуляция работы нитрогеназы.   
Основными  стимулами,  приводящими  к  изменению  экспрессии  генов  нитрогеназы, 
являются следующие факторы: 
-  концентрация кислорода,  
-  концентрация азота или соотношение концентраций азота и аммония,  
-  редокс-состояние  клетки,  то  есть  соотношение  восстановленных  и  окисленных 
форм восстановительных эквивалентов в клетке; 
-  наличие  энергетических  эквивалентов,  поскольку,  как  было  упомянуто  ранее, 
азотфиксация является энергозависимым процессом. 
Согласование  процессов  фиксации  с  присутствием  кислорода  осуществляется  благодаря  
транскрипционной  регуляции  экспрессии  генов  нитрогеназы  в  ответ  на  внеклеточную 
концентрацию  кислорода.  Нитрогеназа  крайне  чувствительна  к  кислороду,  поэтому 
необходимы  механизмы  её  защиты    от  кислородного  повреждения.  У  многих 
азотфиксирующих  микроорганизмов  выработался  широкий  спектр  физиологических 
стратегий  защиты:  анаэробный  рост,  потребление  кислорода  в  дыхании,  временное  и 
пространственное  отделение  нитрогеназы  от  других  процессов,  барьер  для  диффузии 
кислорода.  В  дополнение  обратимое  связывание  О2  нодулином,  специфическим  белком 
корневых  клубеньков,  облегчает  диффузию  О2  низких  концентраций,  поддерживая 
дыхание бактероида с помощью терминальной оксидазы. (Dixon and Kahn, 2004). 
 
Белки -  регуляторы  азотфиксации в ризобиях 
Регуляция  азотфиксации  на  транскрипционном  уровне  осуществляется  целым  рядом 
различных факторов транскрипции. К таким факторам относятся: RpoN – альтернативный 
 
4

сигма-фактор    σ54,  белок NifA, белки  двукомпонентной  системы FixLJ, а  также 
гомологичные белки FixK и FnrN (Fischer, 1994). 
В  данной  работе  мы  сосредоточили  внимание  на  белках FixK и FnrN, регулирующих 
экспрессию  генов  азотфиксации  в  ответ  на  содержание  кислорода  и  активных  в 
микроаэробных условиях. 
 
Структурные особенности белков FixK и FnrN 
Белки FixK и FnrN принадлежат к белковому  семейству Fnr-Crp. Белки этого семейства, 
представляющие собой факторы транскрипции, широко распространены среди бактерий. 
Crp-Fnr-регуляторы  включаются  в  ответ  на  весьма  широкий  спектр  сигналов,  например, 
таких,  как  цАМФ,  недостаток  кислорода  в  среде,  состояние  восстановительных 
эквивалентов клетки, оксид азота, окись углерода, 2-оксоглютарат, кислородный, азотный 
и  температурный  стрессы.  Характерными  особенностями  данного  семейства  являются 
наличие 2 доменов: N-концевого  нуклеотид-связывающего  домена,  похожего  на  цАМФ-
связывающий  домен  белка Crp из  Escherichia coli,  и  С-концевого  ДНК-связывающего 
домена, несущего мотив спираль–поворот–спираль (так называемый HTH-мотив) (Körner 
et. al., 2003). 
Структурно белки FixK и FnrN ближе к подгруппе Fnr, чем к подгруппе Crp. Изначально в 
бактериях  из  порядка Rhizobiales было  обнаружено 3 Fnr-подобных  белка: FixK в 
Sinorhizobium meliloti,  FixK в Azorhizobium caulinodans и FnrN в Rhizobium leguminosarum 
(Anthamatten et. al., 1992).  
Хотя FixK группируют  с FnrN-регуляторами,  считается,  что  они  формируют  ветвь, 
обособленную  от FnrN-группы. FixK-белки  имеют  чёткую  структурную  особенность  –
отсутствие N-концевого  железосерного  кластера,  ответственного  за  аэробно-анаэробные 
транзиции. Не имея чувствительного участка, сенсорного модуля, белки FixK реагируют 
на  изменение  концентрации  кислорода  посредством  других  регуляторов.  Например, 
экспрессия  генов  fixК  в  B. japonicum  и  S. meliloti  активируется  системой FixLJ 
(Anthamatten et. al., 1992) . 
Было показано, что основная функция белков FixK состоит в регуляции экспрессии генов 
микроаэробной  оксидазы,  формирующей  оперон  fixNOQP,  и  благодаря  ей  они  сходны  с 
FnrN-регуляторами. 
FnrN-группа регуляторов содержит белки Fnr-типа с железосерным кластером структуры 
[4Fe-4S].  В  белках FnrNприсутствует  консервативный  цистеиновый  мотив,  характерный 
для Fnr-группы. (Körner et. al., 2003). 
 
5

Несмотря  на  огромное  сходство  структур  и  функций,  между  белками FixK и FnrN есть 
существенное,  ключевое,  различие:  однажды  синтезировавшись  в  микроаэробных 
условиях, FixK будет  регулировать  транскрипцию  и  под  аэробных  условиях; FnrN же  в 
аэробных  условиях  инактивируется  благодаря  О2-чувствительному  кластеру (Colombo et 
al, 2000). Однако  сайты  связывания FixK и FnrN очень  сходны  и  различия  между 
связыванием регуляторов, по всей видимости, лишь в степени афинности. 
 
Цели и задачи 
Азотфиксация представляет собой важный процесс, регулируемый в ответ на множество 
факторов внешней среды за счёт сложных регуляторных каскадов. Однако, в отличие от 
множества  метаболических  путей,  регуляция  которых  изучена  на  примере  одного 
модельного  организма,  например,  E.coli  или  Bacillus subtilis,  регуляция  азотфиксации 
изучалась  на  нескольких  генах  из  различных  организмов,  относящихся  к  порядку 
Rhizobiales.  Поэтому  сведения  о  регуляции  азотфиксации  зачастую  фрагментарны  и 
составление общей картины регуляции требует немалых усилий. 
Целью данной работы явилось изучение регуляции азотфиксации в организмах из порядка 
Rhizobiales  в  ответ  на  микроаэробные  условия.  В  терминах  сравнительной  геномики, 
методы  которой  были  применены  в  данной  работе,  цель  можно  сформулировать  как 
подробное  описание FixK/FnrN-обобщённого  регулона  в  геномах  организмов  из  данной 
группы. 
Эта  работа  является  частью  большого  проекта  по  комплексному  изучению  регуляции 
азотфиксации в геномах организмов из группы Alphaproteobacteria. Другая часть проекта 
посвящена  изучению  регуляции  азотфиксации  в  ответ  на  присутствие  молекулярного 
азота. Такая регуляция осуществляется белками RpoN и NifA. 
В рамках выбранной темы были поставлены следующие задачи: 
-  сбор сведений о генах, регулируемых факторами FixK и FnrN, и экспериментально 
установленных сайтах связывания этих белков; 
-  построение  матриц  для  поиска  потенциальных  сайтов  связывания  белков 
FixK/FnrN; 
-  поиск потенциальных сайтов связывания перед ортологами регулируемых генов; 
-  поиск новых членов регулона. 
 
 
 
 
 
6

Материалы и методы 
Исследованные геномы 
Последовательности  геномов  Bradyrhizobium japonicum,  Rhodopseudomonas palustris
Mesorhizobium loti,  Agrobacterium tumefaciens,  Rhizobium leguminosarum bv. viciae
Sinorhizobium meliloti,  Hyphomonas neptunium,  Rhodobacter capsulatus,  Rhodobacter 
sphaeroides
Silicibacter pomeroyi 
были 
взяты 
из 
базы 
данных GenBank 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ ). 
Методика исследования 
Для  исследования  регулонов  используется  метод  проверки  соответствия  (consistency 
check). Согласно данному методу, ген считается относящимся к регулону, если перед его 
ортологами  в  различных  геномах  были  обнаружены  потенциальные  сайты  связывания 
регулятора (Mironov et. al., 1999). 
Для  поиска  потенциальных  сайтов  связывания  используется  метод  матриц  позиционных 
весов (Gelfand et. al., 2000). 
Программное обеспечение 
Для  построения  диаграмм  лого  для  регуляторного  сайта  использовалась  программа 
WebLogo (Crooks, 2004). 
Для  поиска  потенциальных  сайтов  связывания  использовался  пакет  программ 
GenomeExplorer (Mironov et. al., 2000). 
Построение  множественных  выравниваний  и  филогенетических  деревьев  проводилось  с 
помощью  программы  ClustalX (Thomson et. al., 1997). Для  визуализации  дерева  была 
использована программа GeneMaster (Миронов, неопубликованное). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7

Результаты 
В  работе  была  исследована  регуляция  азотфиксации  в  геномах  организмов  из  группы 
Alphaproteobacteria в микроаэробных условиях FixK/FnrN-белками  
Во  всех  геномах  организмов  из  группы Rhizobiales отобраны  организмы,  для  которых 
характерен  процесс  фиксации  молекулярного  азота.  Для  этого  был  произведен  поиск 
гомологов  генов  нитрогеназы  nifH,  nifE  и  nifК  в  организмах  этой  группы.  В  результате 
поиска  были  отобраны  следующие 5 геномов:  B. japonicum,  R. palustris,  M. loti,  R. 
leguminozarum и R. meliloti.  
В  выбранных  геномах  был  произведён  поиск  гомологов FixK/FnrN. В  дальнейшем  для 
этих  белков  было  построено  множественное  выравнивание  и  филогенетическое  дерево 
(рис.1). 
Рис.1 Филогенетическое дерево FnrN и FixK белков 
Указаны  идентификаторы  генов  из  соответствующей  последовательности  генома.  Первые 2 буквы  в 
названиях указывают на принадлежность к геному: BJ - B. japonicum, RP - R. palustris, ML - M. loti, RL - R. 
leguminozarum и  SM - S. meliloti. 
 
RL024_0124
BJfixK2
SMSMa1141
RP001_1138
0.11 0.11 BJbll3466
RL004_0054
0
BJbll2109
.
0
3
.2
0
0.12
8
0.13
RL004_0063
0.25
0
BJbll7696
.28
0.26
0.12
0
0.23
.22
RL025_1052
0.11
SMfixK1
0.12
0.23
0
SMfixK2
.28
MLmll6632
0.12
0.4
MLmll6578
0.21
1
0.20
MLmlr6409
SMSMa0662
RP001_1110 BJfixK
SMSMc01954
 
 
 
8

Как  видно  из  анализа  дерева,  в  каждом  геноме  присутствует  по  несколько  копий  белка 
FixK  и/или FnrN. Скорее  всего,  используемая  нами  методика  не  позволит 
дифференцировать  сайты  связывания  разных  регуляторов.  Поэтому  в  данной  работе 
решено было исследовать объединённый регулон для всех FnrN/FixK-регуляторов. 
 
Ранее регуляция белками FixK и FnrN была известна для ряда оперонов (см. табл. 1).  
Табл. 1 Опероны, регулируемые FixK и FnrN (по литературным данным) 
Организм 
Регулятор 
Оперон 
Ссылка 
B. japonicum  
FixK 
hemA 
Page KM, Guerinot ML.,1995 
B. japonicum  
FixK(2) 
nosRZDFYLX 
Velasco et.al, 2004 
B. japonicum  
FixK(2) 
nnrR 
Mesa et.al, 2003 
B. japonicum  
FixK(2) 
hemN(1) 
Fischer et.al, 2001 
B. japonicum  
FixK(2) 
hemN(2) 
Fischer et.al, 2001 
B. japonicum  
FixK(2) 
fixK1 
Nellen-Anthamatten et.al, 1998 
B. japonicum  
FixK(2) 
fixNOQP  
Nellen-Anthamatten et.al, 1998 
B. japonicum  
FixK(2) 
fixGHIS 
Nellen-Anthamatten et.al, 1998 
B. japonicum  
FixK(2) 
rpoN1 
Nellen-Anthamatten et.al, 1998 
B. japonicum  
FixK(2) 
fixK2 
Nellen-Anthamatten et.al, 1998 
B. japonicum  
FixK(2) 
hupSL 
Durmowicz and Maier,1998 
R. leguminosarum  
FnrN 
hypBFCDE 
Hernando et.al,1995 
R. leguminosarum  
FnrN 
narGHJI 
Schluter,et al., 1992 
R. leguminosarum  
FnrN 
nirB  
Schluter,et al., 1992 
R. leguminosarum  
FnrN 
fdnGHI 
Schluter,et al., 1992 
R. leguminosarum 
FnrN 
fnrN 
Colombo et al., 2002 
S. meliloti  
FixK 
fixT 
Foussard et.al, 1997 
S. meliloti  
FixK 
fixN 
Soberon et.al, 2001 
S. meliloti  
FixK 
fixT 
Soberon et.al, 2001 
 
 Как видно из таблицы, опероны были описаны для 3 из выбранных нами организмов: B. 
japonicumR. leguminozarum и R. meliloti.  
Для  генов,  перед  которыми  был  найден  сайт  связывания FnrN и FixK, был  произведен 
поиск гомологов с целью найти их ортологи в 2 других организмах R. palustris и M. loti и 
паралоги в этих генах.  
 
 
 
 
 
 
 
 
9


Далее был составлен список сайтов связывания FnrN/FixK-регуляторов перед генами (см. 
табл. 2).  
Табл. 2 Список сайтов связывания FnrN/FixK-регуляторов 
Организм 
Оперон  Сайт (FNR-anaerobox) 
Ссылка 
R.leguminosarum fnrN1 
TTGATCTGGATCAA 
Colombo et al., 2002 
R.leguminosarum fnrN1 
TTGATAATCATCAA 
Colombo et al., 2002 
R.leguminosarum fnrN2  TTGATCTGGATCAA 
Colombo et al., 2002 
R.leguminosarum fnrN2  TTGGTAGTCATCAA 
Colombo et al., 2002 
R.leguminosarum fixNc 
TTGATGTAGATCAA 
Schluter,et al., 1997 
R.leguminosarum fixNd 
TTGACGCAGATCAA 
Schluter,et al., 1997 
B.japonicum norC 
TTGCGCCCTGACAA 
Mesa et al.,2002 
B.japonicum hemA 
TTGATCGGGATCAA Fischer,2001 
B.japonicum hemB 
TTGCGGCAGGTCAA Fischer,2001 
B.japonicum hemN1 
TTGACATAACGCAA Fischer,2001 
B.japonicum hemN2 
TTGCGCGAGCGCAA Fischer,2001 
B.japonicum hupSL 
GCGGTCGCGATCCAGC  Durmowicz and Maier,1998 
B.japonicum hupSL 
TTGAATCGCTCCAGGC  Durmowicz and Maier,1998 
 
 
На  основании  известных  сайтов  связывания  была  построена  матрица  для  поиска 
потенциальных сайтов и диаграммы лого (рис. 2). 
Рис. 2 Диаграмма лого для регуляторных сайтов FnrN и FixK 
По горизонтальной оси указан номер позиции сайта связывания, по вертикальной - информационное 
содержание позиции. Высота столбца пропорциональна информационному содержанию данной позиции, 
относительная высота каждой буквы соответствует частоте нуклеотида в данной позиции. 
 
Перед  найденными  ортологами  регулируемых  генов  был  произведен  поиск 
потенциальных сайтов. Далее отбирались те гены, которые присутствуют как минимум в 
трех  организмах  и  функция  которых  связана  с  фиксацией  молекулярного  азота  и 
метаболизмом азота в целом. Таким образом, в результате отбора генов остались восемь, 
из которых ранее было известно о семи. Ранее неизвестный ген был определен нами как 
новый член регулона. 
 
10

Организмы,  взятые  нами  для  изучения,  принадлежат  к  трем  семействам  порядка 
Rhizobiales: Rhizobiaceae (R. meliloti и R. leguminozarum), Bradyrhizobiaceae (B. japonicum и 
R. palustris)  и Phyllobacteriaceae (M. loti).  В  результатах  излагается  помимо  описания 
структуры  найденных  оперонов  так  же  и  объяснение  присутствия  оперонов  у  этих 
организмов с точки зрения таксономии и эволюции. 
Табл. 3 Гены, включенные в FixK/ FnrN регулон 
Условные  обозначения: «+» - перед  геном  найден  потенциальный  сайт; «*» - потенциальный  сайт  найден 
перед  опероном,  содержащим  данный  ген; «-» - потенциальный  сайт  перед  геном  не  обнаружен; «0» – у 
организма  отсутствуют  ортологи  данного  гена.  Верхние  индексы  показывают  номер  оперона  в  геноме 
организма, если у бектерии присутствует несколько копий оперона или оперон и паралогичный ген. 
Phyllobacteriaceae 
Rhizobiaceae 
Bradyrhizobiaceae 
Ген 
M. loti 
S. meliloti 
R. leguminosarum 
Br. japonicum 
R.palustris 
+1 
+1 
+1 
+1 
+1 
fixN 
-3 
+2 
+2 0 0 
0 -3 
-3 0 0 
*1 
*1 0 *1 0 
fixO 
-3 
*2 0  0 0 
0 -3 0 0 0 
*1 
*1 0 *1 0 
fixQ 
-3 
*2 0  0 0 
0 -3 0 0 0 
*1 
*1 0 *1 0 
fixP 
-3 
*2 0  0 0 
0 -3 0 0 0 
+ + + 
+1 + 
fixG 
+ 0 + + 

*1 
*1 0 *1 0 
fixH 
*2 0 0 0 

*1 
*1 0 *1 0 
fixI 
*2 0 0 0 

*1 
*1 0 *1 0 
fixS 
*2 0 0 0 

+ + + + 

hemN 
- 0 0 


nosR 
0  + 0 + + 
nosZ 
0  * 0 * 0 
nosD 
0  * 0 * 0 
nosF 
0  * 0 * 0 
nosY 
0  * 0 * 0 
nosL 
0  * 0 * 0 
nosX 
0  * 0 * 0 
hemA 
+ + - + 

nifN 
+ - + - 

nifX 
*  - 0 - 0 
nnrR 
0 - 0 + 

fixK(1) 
0 0 - + 

fixK2 
0 0 0 + 

hupS 
0 0 0 + 

hupL 
0 0 0 * 

 
 
11

1) Регуляция оперонов, кодирующих микроаэробную оксидазу FixNOQP с помощью белка 
FixK,  ранее  была  описана  для  двух  организмов - B. japonicum (Nellen-Anthamatten et.al, 
1998) и R. meliloti (Soberon et.al, 2001).  
В R. meliloti присутствует 3 паралогичных оперона fixNOQP, перед двумя из которых есть 
сайты связывания FnrN/FixK. В геноме R. leguminozarum, принадлежащего, как и  
R. meliloti, к семейству Rhizobiaceae, было найдено 3 ортологичных fixN гена, перед одним 
из которых сайта связывания FnrN/FixK обнаружить не удалось.  
В геномах  B. japonicum и R. palustris, относящихся к семейству Bradyrhizobiaceae, 
микроаэробная оксидаза присутствует в одном экземпляре, однако в геноме B. japonicum 
присутствует оперон fixNOQP, а в R. palustris один ген fixN. Сайт связывания FnrN/FixK 
есть в обоих организмах. 
В геноме M. loti было найдено две копии оперона, ортологичного FixNOQP, сайт 
связывания есть только перед одним из них. 
2)  Регуляция  оперона  fixGHIS  ранее  была  описана  для  генома - B. japonicum (Nellen-
Anthamatten et.al, 1998).  
В  этом  геноме  присутствует  одна  копия  данного  оперона,  а  также  паралог  гена  fixG
Сайты  обнаружены  перед  обоими  fixG.  В  организме  R. palustris  оперона  нет,  есть 2 
паралогичных гена, кодирующих белок FixG, но сайт был обнаружен только перед одним 
из них. 
В геноме R. meliloti, как и в B. japonicum, обнаружена одна копия данного оперона, перед 
которой  сайт  связывания FnrN/FixK находится.  У  другого  представителя    семейства 
Rhizobiaceae,  у  R. leguminozarum,  оперона  нет,  однако  присутствуют  два  ортологичных 
fixG гена, перед обоими из которых был найден потенциальный сайт связывания. 
В геноме M. loti оперон, ортологичный fixGHIS, присутствует в двух экземплярах и сайты 
есть перед каждым из них. 
3) Регуляция гена hemN ранее была описана у  B. japonicum (Fischer et.al, 2001).  
В организме R. palustris гена, гомологичного такому, вообще не обнаружено. 
В организмах, принадлежащих семейству Rhizobiaceae, присутствует по одной копии гена, 
кодирующих ортологичные белки, и регуляция этих генов, по-видимому, осуществляется 
белками FnrN/FixK, т.к.  перед  этими  генами  располагаются  потенциальные  сайты 
связывания FnrN/FixK. 
В геноме M. loti такая же ситуация: есть один предположительно регулируемый FnrN/FixK 
ортолог hemN
 4) Регуляция оперона nosRZDFYLX посредством факторов FnrN/FixK была исследована у 
B. japonicum (Velasco et.al, 2004). 
 
12

В геноме R. meliloti присутствует точно такой же регулируемый FnrN/FixK оперон. 
Ортологичный  nosR  и  регулируемый  белками FnrN/FixK ген  обнаружен  также  и  у  R. 
palustris. В остальных организмах ортологов данного гена не встречается. 
5)  Регуляция гена hemA описана в организме B. japonicum (Page and Guerinot,1995). 
В этом организме он присутствует в одном экземпляре. В R. palustris ортологичных этому 
генов  два,  но  только  один  из  них  имеет  перед  собой  потенциальный  сайт  связывания 
FnrN/FixK. 
В  представителях  семейства Rhizobiaceae присутствует  по  одной  копии  ортологичного 
hemA  гена,  однако  сайт  связывания  перед  этим  геном  обнаружен  только  в  геноме  R. 
meliloti; в геноме R. leguminozarum  в этом месте сайта нет. 
В геноме M. loti два ортолога hemA и оба имеют сайты. 
6) Ген nnrR регулируется белком FixK и это описано для B. japonicum (Mesa et.al, 2003). 
Ортологичный ген в R. palustris и R. meliloti не регулируется данным белком, а организмы 
R. leguminozarum  и  M. loti не имеют гомологичных этому генов. 
7)  В  организме  B. japonicum  исследована  авторегуляция  гена  fixK1 (Nellen-Anthamatten 
et.al, 1998). В организме, принадлежащем тому же семейству, в R. palustris перед данным 
геном также был обнаружен потенциальный сайт. 
В остальных организмах ортологов, за исключением R. leguminozarum, ортологов данного 
гена не обнаружено. 
 8) Нами был также определен новый член регулона – ген nifN. Он присутствует во всех 
организмах,  но  потенциальные  сайты  связывания  есть  только  у  R. palustris, R. 
leguminozarum  и  R. leguminozarum.  В  виде  оперона  nifNX  он  присутствует  у  M. loti,  R. 
meliloti  и B. japonicum.  Этот  ген  кодирует  белок,  отвечающий  за  синтез  железо-
молибденового кофактора нитрогеназы. 
 Теперь  вернемся  к  литературным  данным.  Некоторые  из  генов,  для  которых  была 
описана регуляция с помощью белков FnrN/FixK, не вошли в число членов регулона. Это 
произошло по причинам, изложенным ниже. Во-первых, ортологи некоторых генов были 
найдены  только  в  двух  организмах,  поэтому,  по  формальному  критерию, 
сформулированному  в  разделе  «Материалы  и  методы»,  они  не  могут  быть  отнесены  к 
регулону.  Таким  образом  в  это  число  не  попали  ген  fixK2  (регуляция  описана  у Nellen-
Anthamatten et.al, 1998) и ген hupS (Durmowicz and Maier, 1998), присутствующие только у 
представителей семейства Bradyrhizobiaceae. Во-вторых, имеющаяся в настоящий момент 
версия  генома  R. leguminozarum  представляет  собой  неполную  последовательность.  В 
связи  с  этим,  мы  не  нашли  опероны  hypBFCDE  (описан Hernando et.al,1995), narGHJI 
(Schluter,et al., 1992) и  fdnGHI (Schluter,et al., 1992). Ген  nirB  был  найден,  но  он 
 
13

присутствовал только в этом геноме, ортологи в других организмах обнаружены не были. 
Такая  же  ситуация  с  генами  fixT1  и  fixT2 R. meliloti,  регуляция  для  которых  описана 
(Soberon et.al, 2001), но ортологов в изучаемых организмах нет. 
 
Выводы 
1)  На основании литературных данных сконструирована матрица позиционных весов 
и  создано  распознающее  правило  для  поиска  потенциальных  сайтов  связывания 
регуляторных белков FixK и FnrN. 
2)  Методами  сравнительной  геномики  исследована  регуляция  азотфиксации 
посредством белков FixK и FnrN в бактериях порядка Rhizobiales. 
3)  Предсказана регуляция оперона nifNX в геномах R. palustris, R. leguminozarum и M. 
loti
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14

Список литературы 
1.  Anthamatten D., Scherb B., Hennecke H. (1992) Characterization of a fixLJ-regulated 
Bradyrhizobium japonicum gene sharing similarity with the Escherichia coli fnr and 
Rhizobium meliloti fixK genes. J Bacteriol174(7):2111-2120.  
2.  Bedmar E.J., Robles E.F., Delgado M.J. (2005) The complete denitrification pathway 
of the symbiotic, nitrogen-fixing bacterium Bradyrhizobium japonicumBiochem Soc 
Trans. 33(Pt 1):141-144. 
3.  Colombo M.V., Gutierrez D., Palacios J.M., Imperial J., Ruiz-Argueso T. (2000) A novel 
autoregulation mechanism of fnrN expression in Rhizobium leguminosarum bv 
viciae. Mol Microbiol36(2):477-486. 
4.  Cosseau C., Batut J. (2004) Genomics of the ccoNOQP-encoded cbb3 oxidase complex 
in bacteria. Arch Microbiol. 181(2):89-96. 
5.  Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.-M., and Brenner S.E. (2004) WebLogo: A Seguence 
Logo Generator. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 
6.  Dixon R., Kahn D. (2004) Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nat Rev     
Microbiol. 2(8):621-623. 
7.  Durmowicz M.C., Maier R.J. (1998) The FixK2 protein is involved in regulation of 
symbiotic hydrogenase expression in Bradyrhizobium japonicum.  J Bacteriol
180(12):3253-3256. 
8.  Ferrieres L., Francez-Charlot A., Gouzy J., Rouille S., Kahn D. (2004) FixJ-regulated 
genes evolved through promoter duplication in Sinorhizobium melilotiMicrobiology. 
150(Pt 7):2335-2345. 
9.  Fischer H.M. (1994) Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol 
Rev58(3):352-386.  
10. Fischer H.M. (1996) Environmental regulation of rhizobial symbiotic nitrogen 
fixation genesTrends Microbiol4(8):317-320.  
11. Fischer H.M, Velasco L., Delgado M.J., Bedmar E.J., Scharen S., Zingg D., Gottfert M., 
Hennecke H. (2001) One of two hemN genes in Bradyrhizobium japonicum is 
functional during anaerobic growth and in symbiosis. J Bacteriol183(4):1300-1311. 
12. Foussard M., Garnerone A.M., Ni F., Soupene E., Boistard P., Batut J. (1997) Negative 
autoregulation of the Rhizobium meliloti fixK gene is indirect and requires a newly 
identified regulator, FixTMol Microbiol. 25(1):27-37. 
13. Gelfand M.S., Koonin E.V., Mironov A.A. (2000) Prediction of transcription 
regulatory sites in Archaea by a comparative genomic approach. Nucleic Acids Res. 
28(3): 695-705. 
 
15

14. Heinz Körner, Heidi J. Sofia and Walter G. Zumft (2003) Phylogeny of the bacterial 
superfamily of Crp-Fnr transcription regulators: exploiting the metabolic spectrum 
by controlling alternative gene programsFEMS Microbiol Rev. 27(5):559-592. 
15. Hernando Y., Palacios J.M., Imperial J., Ruiz-Argueso T. (1995) The  hypBFCDE 
operon from R.leguminosarum biovar viciae is expressed from an Fnr-type 
promoter that escapes mutagenesis of the fnrN geneJ Bacteriol177(19):5661-5669. 
16. Mesa S., Bedmar E.J., Chanfon A., Hennecke H., Fischer H.M. (2003) Bradyrhizobium 
japonicum NnrR, a denitrification regulator, expands the FixLJ-FixK2 regulatory 
cascade. J Bacteriol185(13):3978-3982. 
17. Mesa S., Velasco L., Manzanera M.E., Delgado M.J., Bedmar E.J. (2002) 
Characterization of the norCBQD genes, encoding nitric oxide reductase, in the 
nitrogen fixing bacterium Bradyrhizobium japonicumMicrobiology148(Pt 11):3553-
3560. 
18. Mironov A.A., Koonin E.V., Roytberg M.A., Gelfand M.S. (1999) Computer analysis 
of transcription regulatory patterns in completely sequenced bacterial genomes. 
Nucleic Acids Res. 27(14): 2981-2989. 
19. Nellen-Anthamatten D., Rossi P., Preisig O., Kullik I., Babst M., Fischer H.M., 
Hennecke H. (1998) Bradyrhizobium japonicum FixK2, a crucial distributor in the 
FixLJ-dependent regulatory cascade for control of genes inducible by low oxygen 
levelsJ Bacteriol180(19):5251-5255. 
20. Page K.M., Guerinot M.L. (1995) Oxygen control of the Bradyrhizobium japonicum 
hemA gene. J Bacteriol177(14):3979-3984. 
21. Palacios J.M., Murillo J., Leyva A., Ditta G., Ruiz-Argueso T. (1990) Differential 
expression of hydrogen uptake (hup) genes in vegetative and symbiotic cells of 
Rhizobium leguminosarumMol Gen Genet. 221(3):363-370. 
22. Raymond J., Siefert J.L., Staples C.R., Blankenship R.E. (2004) The natural history of 
nitrogen fixation. Mol Biol Evol21(3):541-554. 
23. Schluter A., Patschkowski T., Unden G., Priefer U.B. (1992) The  R.leguminosarum 
FnrN protein is functionally similar to E.coli Fnr and promotes heterologous 
oxygen-dependent activation of transcriptionMol Microbiol6(22):3395-3404. 
24. Schluter A., Patschkowski T., Quandt J., Selinger L.B., Weidner S., Kramer M., Zhou L., 
Hynes M.F., Priefer U.B. (1997) Functional and regulatory analysis of the two copies 
of the fixNOQP operon of Rhizobium leguminosarum strain VF39Mol Plant Microbe 
Interact. 10(5):605-616. 
 
16

25. Soberon M., Morera C., Kondorosi A., Lopez O., Miranda J. (2001) A purine-related 
metabolite negatively regulates fixNOQP expression in Sinorhizobium meliloti by 
modulation of fixK expressionMol Plant Microbe Interact14(4):572-576. 
26. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. (1997) The 
CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment 
aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25(24):4876-4882. 
27. Velasco L., Mesa S., Delgado M.J., Bedmar E.J. (2001) Characterization of the nirK 
gene encoding the respiratory, Cu-containing nitrite reductase of Bradyrhizobium 
japonicum. Biochim Biophys Acta. 1521(1-3):130-134. 
28. Velasco L., Mesa S., Xu C.A., Delgado M.J., Bedmar E.J. (2004) Molecular 
characterization of nosRZDFYLX genes coding for denitrifying nitrous oxide 
reductase of Bradyrhizobium japonicumAntonie Van Leeuwenhoek. 85(3):229-235. 
29. Миронов  А.А.,  Винокурова  Н.П.,  Гельфанд  М.С. (2000) Программное 
обеспечение анализа бактериальных геномовМолекулярная биология, т. 34, № 
2, с. 253-262 
30. Мишустин  Е.Н.,  Емцев  В.Т. (1987) Биологическая  фиксация  молекулярного 
азота. Микробиология, ВО «Агропромиздат», М., С. 169-192. 
31. Шлегель Г. (1987) Фиксация молекулярного азота. Под ред. Кондратьевой Е. Н. 
Общая микробиология, «Мир», М., С. 395-402. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17


Похожие:

Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconПлан Введение 3 Понятие дифференциального уравнения и общие сведения о нем 5 > Дифференциальные уравнения первого порядка 13 Методы решений дифференциальных уравнений первого порядка 18
Целью курсовой работы является определение понятия дифференциального уравнения и рассмотрение дифференциальных уравнений первого...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconВнеорганные структуры В системе регуляции 
...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconАзот (общие сведения)
Никакой другой элемент так не лимитирует ресурсы питательных веществ в агроэкосистемах, как азот. Он может стать доступным для живых...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   icon«Исследование  продуктов  речевой  деятельности»,  прошедшей  стажировку  в 
...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   icon«Исследование  продуктов  речевой  деятельности»,  прошедшей  стажировку  в 
...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconИсследование аналитической группы Яндекса, осень 2010
Это исследование посвящено поисковому поведению  пользователей из Украины - что и как они ищут в интернете,  
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconИсследование  операций  представляет  собой  комплекс  научных  методов,  предназначен
Опд. Ф. 10    Теория игр и исследование операций:                                                      Всего 
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconЗдравствуйте, тема нашей сегодняшней лекции “Распознавание и анализ сайтов связывания транскрипционных факторов”
Яторного района соответствует сайту связывания транскрипционного фактора. Следующий уровень- композиционному элементу. Следующий...
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconСтилистический приём литературной  аллюзии  
Аллюзивные денотаты второго порядка и их классификация  по  источнику              
Исследование регуляции азотофиксации   в бактериях порядка Rhizobiales   iconИсследование холокоста
Исследование холокоста, Глобальное видение. Материалы международной Тегеранской конференции 11-12 декабря 2006 года. Под ред. О....
Разместите кнопку на своём сайте:
TopReferat


База данных защищена авторским правом ©topreferat.znate.ru 2012
обратиться к администрации
ТопРеферат
Главная страница